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線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書
點(diǎn)擊次數(shù):1831 更新時(shí)間:2019-04-18

貨號(hào): YJ2273                                                    規(guī)格:25管/24樣

線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

可見分光光度法

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:0.5 mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:液體10mL×2 瓶,4℃保存;

試劑五:粉劑×2 支,-20℃保存;

試劑六:粉劑×2 支,-20℃保存;

產(chǎn)品說明

    線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C 氧化酶,也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C 的氧化,并終把電子傳遞給氧,生成水。還原型細(xì)胞色素C 550nm 有特征光吸收,線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C 生成氧化型細(xì)胞色素C,因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟:

正式實(shí)驗(yàn)前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做與測(cè)定。

一、樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

  1. 準(zhǔn)確稱取0.1g 組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
  2. 將勻漿600g4℃離心5min。
  3. 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g4℃離心10min。
  4. 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ(此步可選做)。
  5. 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。

二、測(cè)定步驟:

  1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm,蒸餾水調(diào)零。
  2. 樣本測(cè)定
  1. 工作液的配制:臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支,將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解。分批配制工作液是為了防止當(dāng)天不能測(cè)完,導(dǎo)致工作液失效。
  2. 將工作液置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑4℃可保存一周;
  3. 1mL 玻璃比色皿中加入40μL 樣本和800μL 工作液,立即混勻,記錄550nm 處初始吸光值A1  1min 后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意:若ΔA 大于0.2,需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),使A1-A2 小于0.2,可提高檢測(cè)靈敏度。

三、復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算:

  1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg 組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

  1. 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g 組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總)÷T=222×ΔA÷W

  1. 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol 還原型細(xì)胞色素C 定義為一個(gè)酶活力單位。

復(fù)合體Ⅳ活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總)÷T=0.444×ΔA

    V 反總:反應(yīng)體系總體積,8.4×10-4 L;ε:細(xì)胞色素C 摩爾消光系數(shù),1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

 

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