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線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)
點(diǎn)擊次數(shù):1579 更新時(shí)間:2019-10-14

貨號(hào):YJ2319                                                   規(guī)格:25管/12樣

線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅴ又稱(chēng)F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線(xiàn)粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過(guò)程水解ATP。此外,復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理

復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制

試劑一:25mL×1瓶,-20℃保存;

試劑二:25mL×1瓶,-20℃保存;

試劑三:1 mL×1瓶,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1支,-20℃保存;臨用前每支加入1.3mL 蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五:6mL×1瓶,4℃保存;

試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加入3mL蒸餾水,充分混勻;溶解后 4℃保存一周;

試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1的比例配制,配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染(請(qǐng)根據(jù)需要,用多少配多少)。

注意:配試劑hao用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

樣本的前處理:

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離:

① 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ(此步可選做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線(xiàn)粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

  • 酶促反應(yīng)

試劑名稱(chēng)(μL)

對(duì)照管

測(cè)定管

試劑四

50

50

試劑五

200

200

樣本

 

250

混勻, 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確水浴 30min

試劑六

100

100

樣本

250

 

混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

  • 定磷

上清液

250

250

定磷試劑

1250

125

混勻,室溫靜置10min左右,在660nm處讀 A測(cè)定管和A對(duì)照管,計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A對(duì)照管。

復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1.2487x + 0.0361;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L),y為A值。

1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min /mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=64×(ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每 g 組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V反總×106]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361)÷1.2487×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×(ΔA-0.0361)

 

V 反總:反應(yīng)體系總體積,6×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.25 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)。

 

線(xiàn)粒體復(fù)合體ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)(微量法)

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滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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