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Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)說明書
點擊次數(shù):2232 更新時間:2021-03-01

                                                                                                                    

Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)說明書

 

6×His-Tagged Protein Purification Kit 

 目錄號:  K0893   

    存:  蛋白酶抑制劑混合物,-20℃;  其它組分,2-8℃。 

 

組分說明 

 

Cat.No.             K0893         K0893A

Volume              2ml            5ml

Ni-Agarose 填料      2ml            5ml

細(xì)菌裂解液          25ml           65ml

尿素                145g           365g

1MTrispH7.9       ml            15ml

1M  咪唑            25ml           65ml

3M 氯化鈉          50ml          125ml

蛋白酶抑制劑混合物   0.3ml          0.7ml

親和柱空柱           1(6ml)      1  (12ml)

 

產(chǎn)品簡介

 

      該鎳柱純化系統(tǒng)對6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力,能夠高效一步純化帶有 6

組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 Ni2+ 螯合位點,較只有3個螯合位點的Ni-IDA 結(jié)合

Ni2+更為牢固,有效防止純化過程中Ni2+脫落且增強對 His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,提高純化

效率。較高的基團(tuán)密度,大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下,對來 源于各種表

達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒,哺乳細(xì)胞,酵母以及細(xì)菌)中的His 標(biāo)簽蛋白,均有很好的純化效果。

本產(chǎn)品已螯合鎳離子,可直接用于包涵體蛋白的純化,使用方便,快捷。  物: CL-6B

瓊脂糖凝膠

      

量:20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料

徑:50-160μm

 

注意事項 

 

1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性,本試劑盒只適合于包涵體蛋白的純化,如需純化

可溶性蛋白,請選擇我公司的可溶性蛋白純化試劑盒,貨號為K0009

2. 緩沖液中不建議使用 β-巰基乙醇、 DTT 和  EDTA

3. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

4. 為提高純化效率,首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的+*佳使用濃度。必

時可以使用線性或梯度濃度的咪唑(10-500mM)洗脫蛋白,并通過SDS-PAGE

WesternBlotting 來檢測目的蛋白的純度。

5. 請使用高純度的試劑配制緩沖液,并通過0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。為避免柱子被

堵塞,建議將裂解液進(jìn)行離心,或者使用0.22µm 或者0.45µm 過濾器過濾。

6. 柱再生時,保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

7. 如果有些蛋白采用尿素的溶解效果不好,可以采用鹽酸胍進(jìn)行溶解。

 

操作步驟 

 

組裝層析柱 

  1. 將填料混勻后加入層析柱,室溫靜置10 分鐘,待凝膠與溶液分層后,把底部的出液口打開,讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

 

注意:(1)填料的上層是乙醇保護(hù)層,將填料和乙醇一起混勻,以每ml填料純化20-30mgHis

標(biāo)簽蛋白計算,取需要的體積的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

2)如果乙醇不流出,可以給柱子一個外力,例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下,迫使乙醇流出。

 

3)本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

 

  2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后,再用8 倍柱體積的

Binding Buffer平衡柱子,平衡結(jié)束后即可上樣。

 

注意:柱體積指的是填料的體積。

 

包涵體蛋白的純化(BindingBufferElutionBuffer配方詳見附表2 

1.  收集菌體后,每100mg菌體(濕重)加入2 ml細(xì)菌裂解液(每1ml 細(xì)菌裂解液中請預(yù)先加

10μl 蛋白酶抑制劑混合物),如有需要可以超聲裂解菌體。

 

注意:(1 當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時,建議加入DNaseILysozyme。每1ml

細(xì)菌裂解液中加入1μlDNaseI1,000U/ml),2μlLysozyme50mg/ml),DNaseI

Lysozyme可單獨從我公司購買,貨號:Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A),如使用其

它公司產(chǎn)品,請按照相應(yīng)說明書操作。

 

2)超聲過程中保持菌液處于冰浴中,超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率,探頭種類,容器

的大小形狀,需實驗中自己摸索,應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱,可分成短時間,多次超

聲,通過一定的間隔時間避免溶液過熱。終以菌液變清即可。

 

2.   10000×g,4℃離心15分鐘,分離上清和沉淀,并收集沉淀。

3.   將沉淀重懸于Binding Buffer中,盡量混勻使包涵體充分溶解。

4.   10,000×g離心20分鐘,收集上清。

 

     注意:建議將離心后的上清以孔徑為0.22µm或者0.45 μm的濾膜過濾。

5.   將上清負(fù)載上柱,流速為10倍柱體積/小時,收集流穿液。

 

     注意:(1)本試劑盒中附帶有一塊篩板,使用時先將篩板加至填料的上層,再將處理好

的上清負(fù)載上柱。該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾,防止過多的雜蛋白堵塞柱子,但是篩

板放入柱子后不易取出。

2)通過控制加入的上清(菌體裂解液)的速度來控制流速。

6.   使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子,洗去雜蛋白。

7.   使用適量Elution Buffer洗脫,收集洗脫峰。

 

注意:通過蛋白監(jiān)測儀監(jiān)測,洗脫峰可以分管收集,每1ml收集1管。

 

8.    洗脫后,依次使用5倍柱體積的Binding Buffer,5倍柱體積的去離子水洗滌柱子,再用3

柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒),4℃保存。 

 

       注意:(1)在純化包涵體蛋白時,所有緩沖液均含有變性劑,可以降低BindingBuffer中的咪唑濃度(比5mM更低)。洗脫時,若蛋白在較高pH下洗脫失敗,可以選用低pH緩沖液作

為洗脫緩沖液(pH6.5pH5.9pH4.5)。 

 

2)如果是分段梯度洗脫,大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500mM,則使用濃度為500mM

的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后,再進(jìn)行第8步的操作。

 

柱再生 

   當(dāng)填料使用多次后,結(jié)合效率會有所下降(表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色),可以用以

下方法再生,提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

 1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后,使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

 2. 使用1 倍柱體積2% SDS沖洗。

 3. 依次使用1 倍柱體積的25%、50%、75%5 倍柱體積100%乙醇沖洗,再依次使用 1 倍柱

體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。

 4. 使用1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用5 倍柱體積含      50 mM EDTA 緩沖液(PH8.0)沖洗。

 6. 使用3 倍柱體積去離子水,3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 

 8. 再次使用前,需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗,然后使用5 個柱體積的50 mM NiSO4

再生,3 個柱體積的Binding Buffer   平衡。

1: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)  

(分子量由大到小分別為:90/66/45/35/27/20kDa

 

2: 全菌裂解液

  

3: 流穿收集液

  

4: 洗脫收集液

  

 

 附表 

 

    

 

                                         附表  1. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

 

成分         Tris-HClPH7.9)   咪唑       NaCl      尿素

 

BindingBuffer      20mM          5mM       0.5M      8M

ElutionBuffer      20mM          500mM      0.5M      8M

 

 

實驗代做服務(wù):

 

免疫組化IHC染色實驗服務(wù)

細(xì)胞、組織TUNEL凋亡染色實驗服務(wù)

試劑盒免費代檢測

實驗室代做實驗項目

 

透射電鏡服務(wù)實驗服務(wù)

石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實驗服務(wù)

免疫共沉淀(CHIRP)實驗

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗代做

酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗體診斷試劑盒

喹諾酮類快速檢測試劑盒

組織芯片/微陣列定制技術(shù)服務(wù)

 

染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實驗服務(wù)

 

多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實驗

免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實驗服務(wù)

ATP/ADP檢測實驗服務(wù)

蛋白雙向(2-D)電泳實驗服務(wù)

蛋白相互作用分析

堿性磷酸酶染色實驗服務(wù)

PKC活性檢測實驗

非標(biāo)定量實驗

(Label-free)

 

DIGE技術(shù)實驗服務(wù)

端粒酶活性檢測實驗

細(xì)胞生長曲線的測定

掃描電鏡服務(wù)

NF-KB p65活性檢測實驗

 

慢病毒包裝實驗服務(wù)

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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