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產(chǎn)品展示Products
基因克隆(獲得目的基因的方法)
基因克?。ǐ@得目的基因的方法)
更新時(shí)間:2025-02-18
訪問量: 1762
廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家

提供商: 上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱: 基因克隆服務(wù)
規(guī)格: 實(shí)驗(yàn)服務(wù)
價(jià)格: 2000元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
歡迎咨詢?cè)斦?,我們?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。
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基因克?。ǐ@得目的基因的方法)產(chǎn)品概述:

基因克隆

 

 

 

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因,也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種,如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴(kuò)增法和人工合成法等,其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 體外擴(kuò)增目的DNA--片段是目前常用的方法。

 

()采用限制性酶切法直接分離目的基因

1、從原核基因組中制備原核基因組相對(duì)較小,用幾種限制性內(nèi)切酶分別消化原核基因組,或用某種限制性內(nèi)切酶對(duì)所要研究的基因組進(jìn)行部分消化,可以得到大小不等的各種片段,其中有些片段就會(huì)含有目的基因,將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆,經(jīng)過篩選,可以得到所需的目的基因。

2.從真核基因組中制備真核基因組比較大,直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多,不易操作。可以用一種限制性內(nèi)切酶先消化基因組DNA,產(chǎn)生連續(xù)的DNA--片段,然后電泳分離這些DNA--片段,再用-段特異探針與這些DNA--片段進(jìn)行雜交,在含有特異性模板的區(qū)域就會(huì)出現(xiàn)雜交帶,可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中,制成基因組文庫,再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進(jìn)行雜交,陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽性克隆測(cè)序,用第--個(gè)克隆片段的末端分離下一個(gè)克隆片段,然后利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去,終可得全部基因序列,這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)。

 

(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細(xì)胞中獲取目的基因片段用于基因操作,這是實(shí)驗(yàn)室中常用的獲取已知基因的方法。

2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據(jù)需要在引物序列上設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)起始密碼子或終止密碼子等,或通過人為錯(cuò)配改變堿基序列(人工突變)對(duì)目的基因進(jìn)行有限修飾。對(duì)于未知基因,可采取構(gòu)建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設(shè)計(jì)共用引物,將所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNA--片段,將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的片段插入到適當(dāng)載體中,構(gòu)建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達(dá)水平很低的mRNA擴(kuò)增出來,有利于篩選出表達(dá)豐度低的基因。由于經(jīng)過PCR擴(kuò)增,基因序列的精que確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。

3.還有一個(gè)獲得目的基因的方法是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)克隆。即利用GenBank中的基因信息,通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性),利用保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物, 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細(xì)胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實(shí)現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。

(三)基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選

1.將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中,得到含有不同插入片段的克隆載體,這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段,這就是基因文庫。若將細(xì)胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中,構(gòu)建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物,這就是cDNA文庫。目前許多組織或細(xì)胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到。

2.當(dāng)獲得了基因組文庫或cDNA文庫,可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針,采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段,這仍是目前獲得新基因的一種常用手段?;蚪M文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和使用請(qǐng)參見本書相應(yīng)的章節(jié)。

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 

免疫組化IHC染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

細(xì)胞、組織TUNEL凋亡染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

 

透射電鏡服務(wù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

免疫共沉淀(CHIRP)實(shí)驗(yàn)

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)代做

酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗體診斷試劑盒

喹諾酮類快速檢測(cè)試劑盒

組織芯片/微陣列定制技術(shù)服務(wù)

 

染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實(shí)驗(yàn)

免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實(shí)驗(yàn)服務(wù)

ATP/ADP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

蛋白雙向(2-D)電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)

蛋白相互作用分析

堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

PKC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

非標(biāo)定量實(shí)驗(yàn)

(Label-free)

 

DIGE技術(shù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

端粒酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長曲線的測(cè)定

掃描電鏡服務(wù)

NF-KB p65活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

 

慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)服務(wù)

 

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